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細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)的步驟說(shuō)明

發(fā)布日期: 2018-08-24
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   細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)的步驟說(shuō)明
  細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟
  天:
  1.在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;
  2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min;
  3.0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);
  4.PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;
  5.吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜;
  第二天:
  6.加熒光二抗:PBST浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;
  注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
  7.復(fù)染核:滴加DAPI避光孵育5min,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,PBST 5min×4次洗去多余的DAPI;
  8.用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
  細(xì)胞爬片抗原修復(fù)液是一種特別適合用于細(xì)胞爬片的快速抗原修復(fù)液,只需室溫孵育5分鐘即可完成對(duì)細(xì)胞爬片樣品使用多聚甲醛、甲醛或其它醛類試劑固定后的抗原修復(fù)。
  使用說(shuō)明:1,細(xì)胞爬片固定后用PBS洗滌3次,每次5min。2,加入抗原修復(fù)液使其覆蓋住細(xì)胞爬片,室溫孵育5min。3,PBS洗滌細(xì)胞爬片,重復(fù)3次,每次5min。充分洗滌殘留的SDS,以免造成抗體失去活性。4,封閉液封閉細(xì)胞爬片。5,隨后即可進(jìn)行一抗孵育等后續(xù)的免疫染色步驟。
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